miRNA研究全套解決方案

基石生命擁有人類miRNA mimics 及antagomir文庫（1000×2），小鼠miRNAmimics及antagomir文庫（600×2），大鼠miRNA mimics及antagomir文庫（500×2）。這些文庫可以應用于大規模高通量篩選，助力廣大科研同仁系統、高效的研究功能，完成項目。

服務內容

情景一：鑒定miRNA的靶基因

一、熒光素酶（Luciferase）雙熒光報告基因實驗鑒定miRNA靶點

a、實驗概述

構建包含miRNA靶位點的luciferase報告基因，與miRNA mimics共轉到細胞當中，通過熒光素酶活性檢測，即可分析出miRNA對潛在靶基因的調控作用，可用于miRNA調控潛在靶基因的驗證。既可以小規模實驗，也可高通量篩選。

原理圖

b、步驟流程

1. 預測miRNA的靶基因及靶位點

協助客戶利用Targetscan，Pictar，miRNA.org，RNA22等常用軟件預測miRNA的binding位點。

2. miRNA靶點鑒定、目的片段獲得：

每個靶點都要做一個對照；每個樣品包含內參和三組重復，根據樣品數而定周期，400*2/個靶點。

成功實例

二、Luciferase突變實驗鑒定miRNA靶點

a、實驗概述

對于前面有效果的miRNA靶基因，將miRNA的binding位點，尤其是seed區突變掉，造成miRNA無法結合，檢測luciferase信號是否恢復。原理圖：（如圖1-1）

b、步驟及流程

1. Luciferase報告基因構建：PCR法，每段突變20個堿基之內，1-2周

2. Luciferase實驗：每個樣品包含內參和三組重復，根據樣品數而定周期。

成功實例

三、mRNA水平鑒定miRNA靶點

a、實驗目的：

由于miRNA作用機制有兩個方面，降低mRNA的表達水平和抑制mRNA的翻譯水平，所以檢測靶點基因的mRNA水平變化將作為一個參考數據，用于分析miRNA作用靶點基因的機制。

b、實驗概述：

對于前面有效果的miRNA靶基因，檢測mRNA水平是否被miRNA下調。

c、具體內容：

將miRNAmimics和陰性參照轉染到細胞中，48-72小時候，提取RNA，熒光定量PCR檢測靶點基因的mRNA水平。900/個靶點+900/對照，2個靶點起訂。

四、Western Blot實驗鑒定miRNA靶點

a、實驗目的

由于miRNA作用機制有兩個方面，降低mRNA的表達水平和抑制mRNA的翻譯水平，所以檢測靶點基因的蛋白水平變化將作為一個參考數據，能全面反映靶點基因的蛋白表達水平的變化，結合mRNA表達水平變化，有助于分析miRNA作用靶點基因的機制。

b、實驗概述：

對于前面有效果的miRNA靶基因，檢測蛋白水平是否被miRNA下調。

Western Blot實驗：每個樣品包含內參，客戶提供一抗。

c、具體內容

將miRNAmimics和陰性參照轉染到細胞中，48-72小時后，裂解細胞進行Western Blot檢測靶點蛋白的水平變化。800/個靶點+800/對照，2個靶點起訂。

成功實例

五、使用靶基因的siRNA驗證靶點

實驗概述

miRNA過表達會引起細胞表型的變化，例如遷移、增殖、凋亡，以及靶基因下游基因表達量變化等等。為了證明miRNA是通過負調控靶基因而引起的這些變化，可以使用靶基因的siRNA，檢測是否會引起同樣的變化。

詳見基因沉默服務內容。

六、使用miRNA的抑制劑（Antagomir）驗證靶點

原理：miRNAantagomir是經過特殊化學修飾的miRNA拮抗劑，通過與體內的成熟miRNA強競爭性結合，阻止miRNA與其靶基因mRNA的互補配對，抑制miRNA發揮作用。

優勢：與普通抑制劑相比，miRNA antagomir在動物體內外具有更高的穩定性和抑制效果，且能克服體內細胞膜、組織等障礙富集于靶細胞。（Antagomir的合成：單鏈的特殊修飾的RNA，2 OD）

實驗概述

對于內源有表達的miRNA，可以使用Antagomir，檢測靶蛋白表達量是否恢復，檢測是否會引起過表達miRNA相反的變化。對于內源沒有表達的miRNA，可以先構建miRNA穩定表達細胞系，再進行上述實驗。

細胞系構建詳參慢病毒穩轉表達細胞系構建。

七、通過rescue靶蛋白檢測功能來驗證靶點

實驗概述

對于內源有表達的miRNA，可以構建cDNA表達質粒，過表達靶蛋白，檢測是否會有rescue miRNA的抑制效果。對于內源沒有表達的miRNA，可以構建miRNA穩定表達細胞系，再進行上述實驗。

細胞系構建詳參慢病毒穩轉表達細胞系構建。

八、miRNA靶基因信號通路總結

實驗概述

利用prePPI,KEGG等生物信息學軟件，總結性分析miRNA調控靶基因及下游信號通路。

成功實例

情景二：已知現象，未知miRNA，發現您感興趣的miRNA 

內容：利用高通量篩選手段，針對您感興趣的現象或者細胞行為，篩選出與此相關的miRNA。

詳情見高通量篩選服務內容。

情景三：已知基因，鑒定調控它的miRNA 

內容：構建包含目的基因3’UTR的luciferase報告基因，與候選miRNA mimics共轉到細胞當中，通過熒光素酶活性檢測，即可分析出miRNA對目的基因的調控作用，既可以小規模實驗，也可高通量篩選。