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miRNA研究全套解決方案
基石生命擁有人類miRNA mimics 及antagomir文庫(1000×2),小鼠miRNAmimics及antagomir文庫(600×2),大鼠miRNA mimics及antagomir文庫(500×2)。這些文庫可以應用于大規模高通量篩選,助力廣大科研同仁系統、高效的研究功能,完成項目。
服務內容
情景一:鑒定miRNA的靶基因
一、熒光素酶(Luciferase)雙熒光報告基因實驗鑒定miRNA靶點
a、實驗概述
構建包含miRNA靶位點的luciferase報告基因,與miRNA mimics共轉到細胞當中,通過熒光素酶活性檢測,即可分析出miRNA對潛在靶基因的調控作用,可用于miRNA調控潛在靶基因的驗證。既可以小規模實驗,也可高通量篩選。
原理圖
b、步驟流程
1. 預測miRNA的靶基因及靶位點
協助客戶利用Targetscan,Pictar,miRNA.org,RNA22等常用軟件預測miRNA的binding位點。
2. miRNA靶點鑒定、目的片段獲得:
目的片段長度 |
獲得方法 |
周期 |
費用(RMB) |
小于500bp(含) |
PCR法 |
1-2周 |
400 |
大于500bp |
全基因合成 |
2-3周 |
2.2/bp |
每個靶點都要做一個對照;每個樣品包含內參和三組重復,根據樣品數而定周期,400*2/個靶點。
成功實例
二、Luciferase突變實驗鑒定miRNA靶點
a、實驗概述
對于前面有效果的miRNA靶基因,將miRNA的binding位點,尤其是seed區突變掉,造成miRNA無法結合,檢測luciferase信號是否恢復。原理圖:(如圖1-1)
b、步驟及流程
1. Luciferase報告基因構建:PCR法,每段突變20個堿基之內,1-2周
2. Luciferase實驗:每個樣品包含內參和三組重復,根據樣品數而定周期。
成功實例
三、mRNA水平鑒定miRNA靶點
a、實驗目的:
由于miRNA作用機制有兩個方面,降低mRNA的表達水平和抑制mRNA的翻譯水平,所以檢測靶點基因的mRNA水平變化將作為一個參考數據,用于分析miRNA作用靶點基因的機制。
b、實驗概述:
對于前面有效果的miRNA靶基因,檢測mRNA水平是否被miRNA下調。
c、具體內容:
將miRNAmimics和陰性參照轉染到細胞中,48-72小時候,提取RNA,熒光定量PCR檢測靶點基因的mRNA水平。900/個靶點+900/對照,2個靶點起訂。
四、Western Blot實驗鑒定miRNA靶點
a、實驗目的
由于miRNA作用機制有兩個方面,降低mRNA的表達水平和抑制mRNA的翻譯水平,所以檢測靶點基因的蛋白水平變化將作為一個參考數據,能全面反映靶點基因的蛋白表達水平的變化,結合mRNA表達水平變化,有助于分析miRNA作用靶點基因的機制。
b、實驗概述:
對于前面有效果的miRNA靶基因,檢測蛋白水平是否被miRNA下調。
Western Blot實驗:每個樣品包含內參,客戶提供一抗。
c、具體內容
將miRNAmimics和陰性參照轉染到細胞中,48-72小時后,裂解細胞進行Western Blot檢測靶點蛋白的水平變化。800/個靶點+800/對照,2個靶點起訂。
成功實例
五、使用靶基因的siRNA驗證靶點
實驗概述
miRNA過表達會引起細胞表型的變化,例如遷移、增殖、凋亡,以及靶基因下游基因表達量變化等等。為了證明miRNA是通過負調控靶基因而引起的這些變化,可以使用靶基因的siRNA,檢測是否會引起同樣的變化。
詳見基因沉默服務內容。
六、使用miRNA的抑制劑(Antagomir)驗證靶點
原理:miRNAantagomir是經過特殊化學修飾的miRNA拮抗劑,通過與體內的成熟miRNA強競爭性結合,阻止miRNA與其靶基因mRNA的互補配對,抑制miRNA發揮作用。
優勢:與普通抑制劑相比,miRNA antagomir在動物體內外具有更高的穩定性和抑制效果,且能克服體內細胞膜、組織等障礙富集于靶細胞。(Antagomir的合成:單鏈的特殊修飾的RNA,2 OD)
實驗概述
對于內源有表達的miRNA,可以使用Antagomir,檢測靶蛋白表達量是否恢復,檢測是否會引起過表達miRNA相反的變化。對于內源沒有表達的miRNA,可以先構建miRNA穩定表達細胞系,再進行上述實驗。
細胞系構建詳參慢病毒穩轉表達細胞系構建。
七、通過rescue靶蛋白檢測功能來驗證靶點
實驗概述
對于內源有表達的miRNA,可以構建cDNA表達質粒,過表達靶蛋白,檢測是否會有rescue miRNA的抑制效果。對于內源沒有表達的miRNA,可以構建miRNA穩定表達細胞系,再進行上述實驗。
細胞系構建詳參慢病毒穩轉表達細胞系構建。
八、miRNA靶基因信號通路總結
實驗概述
利用prePPI,KEGG等生物信息學軟件,總結性分析miRNA調控靶基因及下游信號通路。
成功實例
情景二:已知現象,未知miRNA,發現您感興趣的miRNA
內容:利用高通量篩選手段,針對您感興趣的現象或者細胞行為,篩選出與此相關的miRNA。
詳情見高通量篩選服務內容。
情景三:已知基因,鑒定調控它的miRNA
內容:構建包含目的基因3’UTR的luciferase報告基因,與候選miRNA mimics共轉到細胞當中,通過熒光素酶活性檢測,即可分析出miRNA對目的基因的調控作用,既可以小規模實驗,也可高通量篩選。
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