載體構建服務

TALE技術(Transcriptionactivator-like effectors)是一種分子生物學工具?？茖W家發現，來自植物細菌Xanthomonassp的TAL蛋白的核酸結合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恒定的對應關系。利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊化蛋白。TALEN(Transcription activator-like effector(TAL)nucleases)技術是基于TALE與人工改造的核酸內切酶的切割域(FokI)構建針對任意特定核酸靶序列的重組核酸酶。通過TAL的DNA識別域結合到靶位點上，及FokI切割域形成二聚體后，可特異性對目標DNA序列實現切斷。在隨后的非同源末端連接修復過程中，斷開的DNA雙鏈會由于堿基的隨機增減從而以一定的概率實現目標基因功能的缺失。

將識別特異DNA序列的TALE與內切核酸酶FokI偶聯，可構建成剪切特異DNA序列的內切酶TALEN。而且FokI需形成二聚體方能發揮活性，大大減少了隨意剪切的幾率。在實際操作中，需在目標基因的編碼區或外顯子和內顯子的交界處選擇兩處相鄰（間隔13-22堿基）的靶序列（一般16-20個堿基）分別進行TALE識別模塊構建。將這兩個相鄰靶點識別模塊（分別）融合克隆到FokI的N-末端，形成真核表達載體，得到TALEN質粒對。

將TALEN質粒對共轉入細胞中可實現靶基因敲除。TALEN質粒對共轉入細胞后，表達的融合蛋白，分別與靶位點特異結合，由于兩個TALEN融合蛋白中的FokI臨近，形成二聚體，發揮非特異性內切酶活性，在兩個靶位點之間剪切DNA，形成DSB（Double-Strand Breaks）,誘發DNA損傷修復機制。細胞可以通過NHEJ（Non-homologous End Joining）修復DNA，在此修過程中或多或少地刪除或插入了一定數目的堿基，造成移碼，形成目標基因敲除突變體。

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CRISPR/Cas9載體構建

Clusteredregularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas9是細菌和古細菌的一種不斷進化適應的免疫防御機制。CRISPR的DNA識別區域是crRNA或向導RNA，Cas9蛋白負責DNA的剪切。當DNA結合域識別靶點DNA序列后，核酸內切酶或Cas9蛋白將DNA剪切，靶DNA雙鏈斷裂，再啟動DNA損傷修復機制，實現基因敲除、插入等。

（來自Nature Biotech. 2012:30, 836–838）

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