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CRISPR技術構建植物突變體庫
CRISPR技術構建植物突變體庫
全基因組范圍的植物突變體是進行該植物物種（品種）功能基因組學基礎理論研究，分子品種設計育種和篩選優良性狀的重要材料。傳統T載體隨機插入構建植物突變體庫在擬南芥得到了廣泛應用，但是該方法是工作量巨大，致命缺陷是無法獲得全基因組基因突變庫。而被喻為“遺傳手術刀”的CRISPR/Cas9基因組編輯技術能對特定目標靶基因進行精準的編輯，通常只在靶位點造成幾個堿基的替換、插入或者刪除，這與基因組上時常發生的自然變異或誘導突變本質相同，在農作物分子遺傳改良育種上具有廣闊的應用前景。
利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術和高通量的寡核苷酸芯片合成技術，大規模構建植物突變體庫并進行高通量功能篩選是高效便捷獲得該物種重要突變體和快速克隆對應基因的有效方法，同時能夠為該物種遺傳改良和分子設計育種提供重要的供體材料，為大規模的植物功能基因組學基礎理論研究和品種設計育種提供了一個非常有意義的研究平臺。
CRISPS/gRNA技術構建植物突變體庫的過程
實驗步驟和內容
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步驟 |
說明 |
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gRNA靶點的設計 |
設計gRNA靶點，每個基因3-6個靶點 |
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CRISPR/Cas9-lib載體構建（可選） |
根據CRISPR/Cas9-gRNA表達Ti載體，改造成用于建庫的Ti 載體CRISPR/Cas9-lib。 |
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高通量Oligo pool 合成 |
高通量合成gRNA靶點的oligo pool，每片最多合成12K條oligo |
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gRNA質粒文庫的構建 |
將gRNA靶點構建到CRISPR/Cas9-lib表達載體中，構建gRNA Ti載體質粒文庫。 由于國內感受態效率原因，以12K gRNA靶點為單元，做分文庫 |
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挑單克隆測序檢測文庫質量 |
按照庫gRNA靶點數目10%，挑單克隆測序。 對于12k靶點的分庫，測序120個克隆 |
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高通量測序檢測文庫質量 |
檢驗構建的gRNA Ti載體質粒文庫的質量 |
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gRNA農桿菌文庫構建（可選） |
將gRNA Ti載體質粒文庫轉化到農桿菌中。 |
突變庫構建的前提
1）能在目標植物物種工作的CRISPR/Cas9體系
2）目標植物物種（品種）基因組數據
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